本课题前期研究证明大豆异戊烯基异黄酮（Glyceollins）（来自大豆的植物抗毒素家族）在体外和体内均表现出很强的抗氧化活性。特别是发现这些化合物通过转录因子NF_E2相关因子2（Nrf2）/Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）信号通路来发挥抗氧化作用。而活性氧（ROS）参与了许多神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病，帕金森病和亨廷顿病。由于Nrf2介导的抗氧化酶（包括HO-1）的激活可以保护神经元免受氧化损伤，所以我们假设Glyceollins能够减弱ROS诱导的神经元损伤和认知障碍。因此，预测天然抗氧化剂能够预防或减轻这些疾病的进展。因此，本研究的目的是验证Glyceollins的神经保护和认知增强作用。
在这项研究中，由于大豆衍生的甘油能够诱导不同类型的细胞和组织中的抗氧化酶，作者推测这些化合物可以保护神经元免受ROS的损害。为了检查Glyceollins的神经保护作用，用谷氨酸对从小鼠和小鼠海马HT22细胞收集的原代皮质神经元进行诱导。Glyceollins减弱了从携带Nrf2野生型的小鼠分离的原代皮层神经元中的谷氨酸盐诱导的细胞毒性，但是这些化合物对于从Nrf2敲除小鼠分离是无效的，表明Glyceollins参与介导Nrf2信号通路的神经保护作用。此外，Nrf2主要下游蛋白HO-1的抑制消除了Glyceollins对谷氨酸诱导的ROS产生和细胞毒性的抑制作用，证实了由Glyceollins激活的HO-1负责神经保护的作用。为了检查Glyceollins是否也改善了认知能力，用Glyceollins预处理的小鼠用东莨菪碱激发并进行行为测试。Glyceollins能减弱东莨菪碱引起的小鼠认知障碍，但不能增强Nrf2基因敲除小鼠的记忆力，这表明记忆增强效应也是由Nrf2信号通路介导的。总体而言，Glyceollins显示出对谷氨酸诱导的损伤的神经保护作用，并且以Nrf2依赖性方式减弱东莨菪碱诱导的记忆缺陷。
图1.Glyceollins对谷氨酸诱导的原代皮质神经元兴奋性毒性的减弱作用。在谷氨酸存在下，用Glyceollins（1-10μg/mL）处理从C57BL/6野生型小鼠（白色条）或Nrf2敲除小鼠（黑色条）的胎儿脑中分离的皮质神经元24小时，然后进行MTT测定。条代表平均值±标准差（SD，n=4）。*，**，与未处理对照的统计显着性差异（p0.05）。与单独用谷氨酸处理的阳性对照组相比，统计学显着差异（p0.05）。
图2.MAPK，PI3K和HO-1抑制剂对谷氨酸诱导的Glyceollins神经毒性减弱的作用。将小鼠海马HT22细胞以2x个细胞/孔的密度接种到96孔板中，并以3x个细胞/孔接种到明胶包被的24孔板中用以DAPI染色并评估形态学。（A）在存在Glyceollins（10μg/mL）和谷氨酸（5mM）的情况下用MAPK或PI3K抑制剂处理HT22细胞24小时，随后通过MTT测定评估细胞活力。条代表平均值±SD（n=4）。每个栏上方的标记表示显着差异。*，与未处理对照显着不同（p0.05）。＃，与单独用谷氨酸处理的阳性对照组显着不同（p0.05）;（B）在Glyceollins（10μg/mL）和谷氨酸（5mM）存在下，用ERK抑制剂（SP），JNK抑制剂（PD）或HO-1抑制剂（SnPP）处理HT22细胞24小时，通过DAPI染色并在荧光显微镜下观察以评价细胞毒性（放大倍数倍）。
图3.MAPK，PI3K和HO-1抑制剂对抑制谷氨酸诱导的细胞内由Glyceollins生成的ROS的影响。
（A）将HT22细胞用不同浓度的Glyceollins处理8小时，然后用DCFDA染料在荧光显微镜下观察细胞图像，以评估细胞内ROS水平（放大倍数倍）。（B）细胞用抑制剂预处理2小时，随后在谷氨酸和Glyceollins的存在下另外孵育8小时。用DCFDA染料染色后，通过荧光显微镜观察细胞图像。
图4.Glyceollin诱导Nrf2和HO-1表达的核定位。
（A）将HT22细胞与Glyceollins（10mg/kg）和MAPK和PI3K抑制剂温育6小时，并分离成核和细胞质提取物。每种提取物用于蛋白质印迹分析。使用LaminB和β-actin作为蛋白质加载对照。使用的抑制剂如下：SP（ERK抑制剂，SP），SB（p38抑制剂，SB），PD（JNK抑制剂，PD）或LY（PI3K抑制剂）。（B）将SH-SY5Y细胞与不同浓度的甘油血清孵育12小时，然后进行Western印迹分析HO-1的表达。另外，用HO-1siRNA瞬时转染SHSY5Y细胞，随后用Glyceollins处理24小时。收集全细胞提取物并用于HO-1表达的Western印迹分析。所有实验一式两份进行。
图5.MAPK，PI3K抑制剂对Glyceollins对Nrf2转录激活的影响。
将SHSY5Y-ARE或HT22-ARE细胞系在存在或不存在MAPK和PI3K抑制剂的情况下用甘油酯处理16小时，然后测量萤光素酶活性。条代表平均值±SD（n=4）。*，与SHSY5Y-ARE细胞中的未处理对照显着不同（p0.05）。＃，与HT22-ARE细胞中的未处理的对照显著不同（p0.05）。
图6.Glyceollins对Nrf2野生型小鼠认知功能的影响。
Nrf2野生型C57BL/6小鼠（5周龄，n=9-15）在认知功能或行为测试之前24小时用Glyceollins（10mg/kg）预处理，然后进行Y-迷宫（A）;被动回避（B）;和Morris水迷宫（C）在腹腔注射东莨菪碱（1mg/kg）后测试。数值是平均值±SD（n=9-15）。不同的字母（a，b，c）表示统计学显着性差异。
图7.Glyceollins对Nrf2基因敲除小鼠认知功能的影响。
Nrf2敲除C57BL/6小鼠（5周龄，n=7）在认知功能或行为测试之前24小时用Glyceollins（10mg/kg）预处理，然后进行Y-迷宫（A）;被动回避（B）;和Morris水迷宫（C）在腹腔注射注射东莨菪碱（1mg/kg）后测试。条上的不同字母（a，b）表示统计上显著的差异。
图8.Glyceollins对小鼠大脑皮层和海马区匀浆中AChE的抑制作用。
将从皮层或海马区分离的神经元细胞匀浆并用于测定Glyceollins血清对AChE的抑制活性。数值是平均值±SD（n=7）。条上的不同字母（a-f）表示显着差异。从小鼠脑中分离皮质和海马神经元细胞，并使用它们的匀浆测定Glyceollins对AChE的抑制活性。
通过本实验，可以预测Glyceollins有可能用于预防神经退行性疾病以及与年龄有关的记忆缺陷。未来对人类Glyceollins的认知增强作用的研究及其精确的作用模式，对于其用作食品成分和用于医疗目的是具有保障的。
